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ELISAについてです。

 

2007/12/04 日記

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ELISA

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) は、試料中に含まれる抗体あるいは抗原の濃度を検出・定量する際に用いられる方法である。「酵素結合免疫吸着法」などの訳語があるが定訳はなく、一般に、エライサあるいはエライザと呼ばれる。生体試料中には、種々雑多な蛋白質|タンパク質が存在するが、特定のタンパク質を検出・定量するには、特に他のタンパク質と比べて微量にしか存在しない場合は、特異性の高さ（夾雑物からどれだけ正確に区別できるか）と定量性の良さ（微量であっても検出できる、あるいは低濃度における再現性の良さ）が求められる。ELISAは特異性の高い抗原抗体反応を利用し、酵素反応に基づく発色・発光をシグナルに用いることで上記の条件をクリアしている。ELISAは、同様の原理に基づく放射免疫測定（ラジオイムノアッセイ、RIA）と比べて、放射性物質を用いないため安全性が高く、安価で簡便であるため、現在微量タンパク質や感染微生物抗原の検出・定量に広く用いられている。

方法

以下に、タンパク質を定量する際に用いられる方法のうち代表的な物を記載する。いずれの方法においても、検量線を作成し、そこから定量する方法が一般的である。

直接吸着法

試料溶液を固相（プラスチックチューブ、マイクロプレート、ガラスビーズなど）に接触させて吸着させる。

抗原抗体反応および酵素反応に関与しないタンパク質（スキムミルク、アルブミンなど）を固相に吸着させる。（ブロッキング）

目的のタンパク質に特異的な抗体を固相に接触させて、抗原抗体反応を起こさせる。

反応しなかった余分な抗体を洗い流す。

3.のステップで加えた抗体に酵素が標識していない場合は、3.の抗体（一次抗体）と特異的に反応する抗体（酵素標識済み、二次抗体）を作用させる。その後、余分な二次抗体を洗い流す。

酵素の基質（通常、発色あるいは発光試薬）を加え、酵素反応の生成物を検出する。この方法は簡便であるが、最初のステップにおいて目的タンパク質以外のタンパク質が多量に存在する場合は、それらのタンパク質の影響を受けてしまうため、定量性が悪くなる。また、タンパク質によっては微量な領域での吸着が定量的でなくなるなど、タンパク質の量および性質により定量性が悪くなる欠点を持っている。

サンドイッチ法

目的タンパク質（抗原）に対する抗体（捕獲抗体）を固相に吸着させる。

スキムミルクなどで固相のブロッキングを行う。

固相に試料溶液および捕獲抗体とは別のエピトープを認識する一次抗体を加える。この時点で、固相 - 捕獲抗体 - 抗原 - 一次抗体という複合体が固相表面に形成される。

反応しなかった抗原および一次抗体を洗い流す。

一次抗体に酵素が標識されていない場合は、酵素標識済みの二次抗体を作用させる。その後、余分な二次抗体を洗い流す。

酵素の基質（通常、発色あるいは発光試薬）を加え、酵素反応の生成物を検出する。本方法を行うには、同一タンパク質を異なるエピトープで認識する抗体が必要となる。また、抗体の立体障害を考えると、近位ではなく遠位（アミノ酸配列上でなく立体構造上の遠位）を認識することが望ましい。最大の利点は、同一タンパク質を捕獲抗体と一次抗体の2種類の抗体を用いて検出する性質上、特異性が非常に高い方法である。ただし、固相に吸着させる捕獲抗体の量が少ない場合、試料中の抗原は捕獲抗体以上の量が結合できないため、定量性が悪くなることがある。

競合法

既知濃度の目的タンパク質（抗原）標準品を一定量固相に吸着させる。

スキムミルクなどで固相のブロッキングを行う。

固相に試料および一次抗体を作用させる。

反応しなかった抗原および一次抗体を洗い流す。

一次抗体に酵素が標識されていない場合は、酵素標識済みの二次抗体を作用させる。その後、余分な二次抗体を洗い流す。

酵素の基質（通常、発色あるいは発光試薬）を加え、酵素反応の生成物を検出する。この方法は、直接吸着法における微量タンパク質の定量性の低さを改善し、抗原に対して一種類の抗体で高感度に検出できる方法である。ただし、直接結合法と同様に用いる抗体によっては、交差反応により十分な特異性が得られないときがある。このような場合には何らかの前処理が必要となる。

脚注

タンパク質は表面電荷や疎水相互作用によりこれらの表面に非特異的に吸着する。一般に、タンパク質を固相に吸着させる場合は、タンパク質の等電点よりもアルカリ側の方が良いとされる。

ブロッキングは、酵素抗体反応および酵素反応に無関係なタンパク質で固相表面を覆い、後のステップで作用させるタンパク質が固相表面に吸着されるのを防ぐ目的で行われる。

二次抗体を用いるメリットとして以下の点が考えられる。二次抗体（通常ポリクローナル抗体を用いる）は一次抗体に複数箇所で結合するため、一つの一次抗体に対して複数の二次抗体、すなわち複数の酵素で標識することができる。したがって、二次抗体を使用することで増感効果を得ることができる。また、一次抗体に酵素を標識すると、定量したいタンパク質に対する抗体ごとに酵素標識を施さなくてはならないが、二次抗体を用いることで一次抗体に酵素を標識する必要がなく、複数のタンパク質の検出に対して、用意する酵素標識抗体が一種類でよいため経済的である。

一般的に、抗体に結合させる酵素には西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP、HorseRadish Peroxydase）あるいはアルカリホスファターゼ（ALP、 Alkaline Phosphatase）が用いられる。

加えられた抗体は、固相に吸着している抗原および試料中の抗原に等しく反応を起こし、その反応は定量的に起こる。したがって、固相に結合する一次抗体量は試料中の抗原濃度に依存し、試料中の抗原が多ければ多いほど、結合する一次抗体量は少なくなる。